4. Cryopréservation

Schéma du processus d'encapsulation (A) et de cryopréservation (B).

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A. A partir d'une culture monoxénique, les spores sont succesivement isolées à l'aide de micropipettes après solubilisation du milieu de culture par le tampon citrate (Doner and Bécard, 1991) (1), transférées dans une solution d'alginate de sodium à 20 g/l (2) et incorporées goutte à goutte dans une solution de chlorure de calcium 0.1M pour la polymérisation (3) (Declerck et al., 1996). Après l'encapsulation des spores, les billes sont récupérées de la solution de CaCl2 et maintenues à 15°C durant la nuit et cryopréservées.

B. Les billes sont incubées à 4°C dans du tréhalose 0.5M pendant 1 jour (4), transférées dans des cryotubes (5) et soumises à une descente en température (6) en deux étapes : une étape lente (-1 °C/min) de la température ambiante jusqu'à -35 °C et une étape rapide (- 18 °C/ min) de -35 °C à - 100 °C. Les billes sont ensuite stockées à cette température (7) avant décongélation par immersion dans un bain à température ambiante (8). Les billes sont ensuite incubées sur le milieu de culture, et celles présentant une germination sporale sont ré-associées avec une racine de carotte transformées afin d'initier une nouvelle culture monoxénique (9).

Cette méthodologie a été développée avec succès pour Glomus intraradices (MUCL 41835).

Pour plus d'information :

Declerck S. and Angelo-Van Coppenolle M.G. (2000) Cryopreservation of entrapped monoxenically produced spores of an arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist 148: 169-176

Doner L.W. and Bécard G. (1991) Solubilization of gellan gels by chelation of cations. Biotechnology Techniques 5: 25-28

Declerck S., Strullu D.G., Plenchette C. and Guillemette T. (1996) Entrapment of in vitro produced spores of Glomus versiforme in alginate beads: in vitro and in vivo inoculum potentials. Journal of Biotechology 48: 51-57